Kit de purification de l'ARN total

Figure 2. Amplification des petits et grands ARN dans la même extraction. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler la gamme complète des tailles d'ARN, y compris les petits ARN, sans utiliser du phénol. L'ARN total a été isolé à partir de 0,75 million de cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen, de divers concurrents à base de silice et du réactif TRI à base de phénol. La RT-PCR a été réalisée conformément à Shi et Chiang (2005). Quinze microlitres des 50 µL d'ARN isolé ont été polyadénylés dans une réaction Poly-(A)-Polymérase de 50 µL. Quatre microlitres d’ARN polyadénylé ont été utilisés dans une réaction de transcription inverse de 20 μL avec un amorce d’adaptateur polyT. Un microlitre de la transcription inverse a été utilisé dans une réaction qPCR de 20 µL avec des amorces contre les microARN humains (miR-19 et miR-21) et le grand ARNm (S15). Seule l'utilisation du kit de purification de l'ARN total de Norgen a permis de détecter à la fois des microARN et des produits d'amplification de l'ARNm, comme avec le kit du concurrent 2, mais sans utiliser de phénol.

Figure 3. Haute qualité de l'ARN à partir d'une gamme diversifiée de donnés. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler l'ARN d'un large éventail d'espèces ou de types de tissus. L'ARN total a été isolé à partir de 5 x 108 cellules E. coli, 1 x 106 cellules HeLa, 100 µL de sang de rat et 10 mg de rein de hamster à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen. Un microlitre des 50 µL d'ARN isolé a été analysé sur le bioanalyseur Agilent® 2100 à l'aide d'une puce RNA Nano 6000. Note l'intégrité de l'ARN de toutes les entrées avec la présence de petites espèces d'ARN. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler de manière cohérente un ARN de haute qualité à partir de divers intrants dont la valeur RIN est comprise entre 8 et 10.

Figure 4. Grande sensibilité à l’isolement. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet une extraction sensible de l'ARN à partir d'une seule cellule. L'ARN total a été extrait d'un nombre décroissant de cellules HEK 293, allant de 1 million de cellules à une seule cellule. Cinq microlitres des 50 µL d'ARN isolé ont ensuite été soumis à une transcription inverse de 20 µL en utilisant l'amorce oligo dT. Trois microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR de 20 µL avec des amorces pour détecter les transcrits de la bêta-actine humaine. Des produits PCR de bêta-actine ont été détectés à partir d'une seule cellule. M est la ligne de démarcation.

Figure 5. Isolation linéaire et sensible des petits et grands ARN. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler de manière cohérente les petits et les grands ARN à partir de différentes quantités d'intrants. L'ARN total a été isolé à partir de 10 à 100 000 cellules HeLa en utilisant le kit de purification de l'ARN total de Norgen (bleu), un kit à base de silice de concurrents (vert) et une méthode d'extraction de l'ARN à base de phénol (rouge). L'expression relative des miR-21 (panneau A) et S15 (panneau B) a été déterminée par RT-qPCR à partir d'échantillons d'ARN total. En bref, un microlitre des 50 µL d'ARN isolé a ensuite été soumis à une transcription inverse de 20 µL en utilisant l'amorce inverse de la boucle de tige miR-21 ou l'amorce oligo dT. Deux microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR en temps réel de 20 µL avec des amorces pour détecter le miR-21 humain (panneau A) et les transcrits S15 (panneau B). Les valeurs de cycle seuil (Ct) qui en résultent ont été tracées en fonction du nombre de cellules d'entrée. L'ARN isolé à l'aide de Norgen's Total RNA Purification présentait la meilleure linéarité (R2 plus élevé) et la meilleure sensibilité (Ct plus bas) à la fois pour le grand ARN (S15) et le petit ARN (miR-21).

Figure 6. Détection efficace et cohérente des ARN micro dans le plasma. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler efficacement l’ARN micro du plasma. L'ARN total a été isolé à partir de 50, 100 ou 200 µL de plasma de rat en trois exemplaires en utilisant le kit de purification de l'ARN total de Norgen (bleu), un kit à base de silice de concurrents (vert) et une méthode d'extraction de l'ARN à base de phénol (rouge). Une RT-qPCR en boucle de tige utilisant des amorces spécifiques à miR-21 a été réalisée. En bref, deux microlitres des 50 µL d'ARN isolé ont ensuite été soumis à une transcription inverse de 20 µL en utilisant l'amorce inverse de la boucle de tige miR-21 ou l'amorce oligo dT. Trois microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR en temps réel de 20 µL avec des amorces pour détecter le miR-21 humain. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen est le seul produit qui a montré (1) une détection cohérente des transcrits miR-21 pour tous les volumes d'entrée, et (2) des valeurs de Ct en corrélation avec le volume d'entrée (diminution de Ct avec l'augmentation de l'entrée).

Figure 7. Récupération de diverses espèces d’ARN micro dans le plasma avec une meilleure cohérence. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet d'isoler l'ARN plasmatique qui est plus performant dans les applications en aval telles que les puces à ADN. L'ARN total, y compris les ARN micro, a été isolé à partir de 100 µL de plasma de souris en double en utilisant le kit de purification de l'ARN total de Norgen, le principal kit d'ARN micro du concurrent 1 ou une méthode d'extraction de l'ARN à base de phénol. Cent nanogrammes d'ARN extrait de chaque kit ont été appliqués à un kit de profilage de l'expression des ARN micro d'Illumina. Les diagrammes de dispersion montrent une meilleure cohérence (meilleur regroupement) des signaux répétés des échantillons de Norgen. Les gènes dont la Pval < 0,01 pour les deux répétitions sont en bleu. Le tableau associé a suggéré que le protocole de Norgen a récupéré la même diversité d’ARN micro avec une meilleure cohérence (valeur r2 plus élevée).

Figure 8. Meilleure diversité des ARN micro détectés dans le plasma. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen isole les ARN micro du plasma avec une meilleure diversité qu'un concurrent de premier plan. L'ARN total incluant les ARN micro a été isolé à partir de 100 µL de plasma à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen ou de 625 µL de plasma à l'aide du principal kit ARN micro du concurrent A, et a été appliqué à un kit de profilage d'expression NCode. Les images de biopuces suggèrent que le kit de purification de l'ARN total de Norgen (à gauche) isole une meilleure diversité d’ARN micro à partir d'une plus petite quantité de plasma que le kit ARN micro concurrent (à droite). Avec l'aimable autorisation de LC Sciences, Houston.

Figure 9. Meilleure diversité des ARN micro détectés dans les cellules HeLa à l'aide du séquençage de la prochaine génération des petits ARN d'Illumina. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen isole les ARN micro des cellules HeLa avec une meilleure diversité qu'un concurrent éminent. L'ARN total, y compris les ARN micro, a été isolé à partir d'un million de cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen et du kit ARN micro de Competitor Q. Il a ensuite été utilisé pour le séquençage de la prochaine génération des petits ARN d'Illumina sur un séquenceur MiSeq. Le panneau A montre que le kit de purification de l'ARN total de Norgen récupère un plus grand nombre d’ARN micro que son concurrent. En particulier, la plus grande diversité est obtenue gr&#226;ce à une procédure plus rapide et plus simple, en seulement 20 minutes de temps de préparation de l'échantillon d'ARN, sans utilisation de phénol. Le panneau B est un diagramme de dispersion de la moyenne des LPM (lectures par million) des ARN micro détectés, utilisé pour comparer la récupération des ARN micro par Norgen et par les kits concurrents. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen a récupéré un nombre significativement plus élevé d’ARN micro ayant des LPM plus élevées, comme le résument le graphique et le panneau C.

Figure 10. Rendement constant d'ARN de haute qualité avec une gamme complète de tailles sans utilisation de phénol.. Le kit de purification de l'ARN total 96 puits de Norgen permet d'isoler de manière cohérente un ARN de haute qualité, avec des tailles complètes allant de l'ARN de très grande taille à l'ARN de petite taille, sans utiliser de phénol. L'ARN total a été isolé à partir d'aliquotes de 0,5 mL d'une culture d'E. coli d'une nuit (~5 x 108 cellules/mL) à l'aide du kit de purification de l'ARN total à 96 puits de Norgen, en 16 répétitions. Cinq microlitres des 75 µL d'ARN isolé ont été résolus sur un gel d'agarose à 1,2 % de formaldéhyde. Les 16 répétitions ont montré un rendement et une qualité élevés. En outre, toutes les répétitions ont montré une récupération efficace de toutes les tailles d'ARN, y compris le petit ARN (flèche).

Figure 11. Haute qualité de l'ARN à partir d'une gamme diversifiée d'intrants.Le kit de purification de l'ARN total 96 puits de Norgen permet d'isoler l'ARN d'un large éventail d'espèces et de types de tissus. L'ARN total a été isolé à partir de 8 mg de cerveau (voies A), de rein (voies B), de foie (voies C), de poumon (voies D) et de tissu de rate (voies E), de 7,5 x 105 cellules HeLa (voies F) et CHO (voies G), et de 5 x 108 bactéries (voies H) à l'aide du kit de purification de l'ARN total à 96 puits de Norgen. Cinq microlitres des 75 µL d'ARN isolé ont été résolus sur un gel d'agarose à 1,2 % de formaldéhyde. L'observation du gel de formaldéhyde-agarose montre que le kit de Norgen peut être utilisé pour isoler avec succès l'ARN total, y compris les petites espèces d'ARN, à partir d'un large éventail de types d'échantillons.

Figure 12. Isolement des petits et grands ARN. Le kit de purification de l'ARN total 96 puits de Norgen permet d'isoler de manière cohérente les petits et les grands ARN.L'ARN total a été isolé à partir d'échantillons de 5 x 105 cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN total à 96 puits de Norgen. Des aliquotes de chaque échantillon d'ARN total ont ensuite été utilisées dans deux réactions différentes de RT-qPCR. Dix microlitres des 75 µL d'ARN isolé ont été soumis à une transcription inverse de 20 µL en utilisant l'amorce inverse de la boucle souche de miR-21 ou l'oligo dT. Trois microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR en temps réel de 20 µL avec des amorces pour détecter le miR-21 humain (panneau A) et les transcrits S15 (panneau B), respectivement. L'ARNm et l’ARN micro ont été amplifiés de manière cohérente à partir de tous les échantillons, avec une faible variabilité des valeurs Ct. Ainsi, les deux types d'ARN sont régulièrement isolés à l'aide de ce kit.

Figure 13. Grande sensibilité à l'isolement.Le kit de purification de l'ARN total de Norgen permet une extraction sensible de l'ARN à partir de moins de 10 cellules. La RT-qPCR a été utilisée pour détecter l'ARNm isolé à partir de différentes quantités de cellules HeLa, de 100 000 à une seule cellule, à l'aide du kit de purification de l'ARN total à 96 puits de Norgen. Dix microlitres des 75 µL d'ARN isolé ont ensuite été soumis à une transcription inverse de 20 µL à l'aide d'amorces oligo dT. Trois microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR en temps réel de 20 µL avec des amorces pour détecter les transcrits S15 humains. Les valeurs Ct obtenues ont été tracées en fonction du nombre de cellules d'entrée. L'ARN total a été isolé et détecté de manière linéaire à partir d'une seule cellule HeLa.