Kits de purification de l'ARN du plasma/sérum

Figure 2. Élution de l'ARN circulant purifié dans différents volumes d'élution. Le kit mini de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen a été utilisé pour purifier l'ARN circulant à partir de 200 µL de plasma préparé à partir de sang collecté sur EDTA et élué dans 10 µL, 15 µL et 25 µL. Trois microlitres de l'ARN purifié ont ensuite été utilisés comme modèle dans des réactions de RT-qPCR pour détecter le miR-21 (figure 2A) et le transcrit de l'ARNr 5S (figure 2B). La quantité relative du miR-21 (figure 2A) et du transcrit de l'ARNr 5S (figure 2B) augmente avec le volume d'élution, ce qui indique une concentration efficace de l'ARN circulant dans le plasma dans un volume d'élution très faible.

Figure 3. Détection efficace et cohérente des ARN micro dans le plasma. Le kit mini de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen permet d'isoler efficacement l’ARN micro du plasma. Les ARN micro circulants ont été isolés à partir de 200 µL de plasma à l'aide du mini kit de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen, du kit de son concurrent Q et du kit de son concurrent E. Les ARN micro circulants ont été isolés à partir de 600 µL à l'aide du kit du concurrent A. Une RT-qPCR en boucle de tige utilisant des amorces spécifiques à miR-21 a été réalisée. En bref, 1 microlitre des 15 µL d'ARN purifié à l'aide du kit mini de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen, du kit du concurrent Q et 3,3 microlitres des 50 µL d'ARN purifié à l'aide du kit du concurrent E et du kit du concurrent A ont ensuite été soumis à une transcription inverse de 20 µL à l'aide de l'amorce inverse de la boucle souche miR-21. Trois microlitres de la transcription inverse ont été utilisés dans une réaction PCR en temps réel de 20 µL avec des amorces pour détecter le miR-21 humain. Le mini kit de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen a montré la récupération la plus cohérente et la plus élevée des transcrits miR-21 par rapport aux autres méthodes d'isolation. La récupération d’ARN micro à partir de 200 µL de plasma à l'aide du kit de Norgen était supérieure à celle obtenue à partir de l'ARN purifié à partir de 600 µL à l'aide du kit du concurrent A.

Figure 4. Les séquences de petits ARN à partir d’aussi peu que 50 μL de plasma. Norgen Biotek a développé un pipeline efficace pour le séquence de petits ARN à partir de petits volumes de plasma/sérum. L'ARN peut être récupéré de manière efficace et cohérente à partir de seulement 50 µL de plasma en utilisant la technologie de préparation d'échantillons brevetée de Norgen (exemple montré ici avec le mini kit de purification de l'ARN du plasma/sérum, Cat. 55000). Le panneau A montre que le nombre de microARN détectés à partir de 50 ou 200 µl de plasma était presque identique à celui de 4 ml. Le panneau B est un diagramme de Venn montrant que la majorité des ARN micro identifiés sont détectés dans tous les volumes de plasma entrant, de 50 µl à 4 ml. En fait, les diagrammes de dispersion du panneau C montrent que le niveau d'expression relative de chaque ARN micro détecté était fortement corrélé entre 50 ou 200 µl de plasma et 4 ml de plasma.

Figure 5. Degré élevé de chevauchement du profil ARN micro entre l'urine et le plasma. Du plasma et de l'urine à mi-parcours ont été prélevés sur trois individus sains différents. L'ARN a été isolé à partir de 20 mL de chaque échantillon d'urine à l'aide du kit de purification de l'ARN exosomal de l'urine de Norgen (Cat. 47200) et 200 µL de chaque échantillon de plasma en utilisant le mini kit de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen (Cat. 55000). Des petites bibliothèques d'ARN ont ensuite été générées à l'aide d'un kit de préparation de petites bibliothèques d'ARN TruSeq d'Illumina, puis séquencées sur un système MiSeq d'Illumina. La liste des ARN micro cartographiés provenant du plasma et de l'urine d'un même individu a ensuite été comparée. Les diagrammes de Venn ont montré que les profils de ARN micro se chevauchent largement entre l'urine et le plasma pour chaque individu.

Figure 6. Diversité accrue d'autres espèces de petits ARN (interagissant avec Piwi) dans l'urine. Du plasma et de l'urine à mi-parcours ont été prélevés sur trois individus sains différents. L'ARN a été isolé à partir de 20 ml de chaque échantillon d'urine à l'aide du kit de purification de l'ARN exosomal de l'urine de Norgen (Cat. 47200) et 200 µL de chaque échantillon de plasma en utilisant le mini kit de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen (Cat. 55000). Des petites bibliothèques d'ARN ont ensuite été générées à l'aide d'un kit de préparation de petites bibliothèques d'ARN TruSeq d'Illumina, puis séquencées sur un système MiSeq d'Illumina. Le graphique ci-dessus montre que la proportion relative d'ARN interagissant avec piwi (ARNpi) est systématiquement plus élevée dans l'urine.

Figure 7. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen isole les ARN micro des cellules HeLa avec une meilleure diversité qu'un concurrent de premier plan. L'ARN total, y compris les ARN micro, a été isolé à partir d'un million de cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN total de Norgen et du kit ARN micro de Competitor Q. Il a ensuite été utilisé pour le séquence de la prochaine génération des petits ARN d'Illumina sur un séquenceur MiSeq. Le panneau A montre que le kit de purification de l'ARN total de Norgen récupère un plus grand nombre d’ARN micro que son concurrent. En particulier, la plus grande diversité est obtenue grâce à une procédure plus rapide et plus simple, en seulement 20 minutes de temps de préparation de l'échantillon d'ARN, sans utilisation de phénol. Le panneau B est un diagramme de dispersion du RPM moyen (lectures par million) des ARN micro détectés pour comparer la récupération des ARN micro par Norgen et par les concurrents. Le kit de purification de l'ARN total de Norgen a récupéré un nombre significativement plus élevé d’ARN micro ayant des LPM plus élevées, comme le résument le graphique et le panneau C.

Figure 8. Purification de l'ARN circulant acellulaire et de l'ARN exosomal à partir de différents volumes de plasma.Le kit Midi de purification de l'ARN du plasma/sérum Norgens (Cat# 56100) a été utilisé pour purifier l'ARN circulant et exosomal acellulaire à partir de 0,25 mL, 0,75 mL et 1,5 mL de plasma préparé à partir de sang prélevé sur du citrate comme anticoagulant. Deux microlitres de l'ARN purifié ont ensuite été utilisés comme modèle dans des réactions de RT-qPCR pour évaluer l'amplification du transcrit de l'ARNr 5S de base (A) et du miR-21 (B). La valeur moyenne de Ct pour le transcrit de l'ARNr 5S et le miR-21 diminue de façon linéaire avec l'augmentation du volume d'entrée de l'échantillon.

Figure 9. Linéarité de l'ARN purifié à partir de volumes croissants de plasma à l'aide du kit Midi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen.. Le kit Midi de purification de l'ARN du plasma/sérum Norgen (Cat# 56100) a été utilisé pour purifier l'ARN à partir de 0,25 mL, 0,7 mL et 1,5 mL de plasma préparé à partir de sang prélevé sur du citrate comme anticoagulant. Deux microlitres de l'ARN purifié ont ensuite été utilisés comme modèle dans les réactions de RT-qPCR pour évaluer la linéarité (A) du transcrit de l'ARNr 5S de référence et (B) du miR-21 à partir des différents volumes de plasma. Le kit Midi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen a permis de récupérer 97 % du transcrit de l'ARNr 5S et du transcrit du miR-21 à partir de 0,75 mL de plasma par rapport à la quantité présente dans 0,35 mL de plasma. En outre, 95 % du transcrit de l'ARNr 5S et du miR-21 ont été récupérés à partir de 1,5 mL de plasma par rapport à la quantité présente dans 0,75 mL de plasma.

Figure 10. Détermination de la quantité d'inhibition présente dans les échantillons d'ARN plasmatique lors de la détection du transcrit 5S humain et du miR-21. L'ARN a été isolé à partir de 0,25 ml, 0,75 ml et 1,5 ml de plasma à l'aide du kit Midi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen (Cat# 56100). Des volumes croissants de l'élution (2, 4 et 8 µl) ont été utilisés dans une réaction de transcription inverse de 20 µl suivie d'une réaction d'amplification par qPCR afin d'observer toute diminution de la valeur Ct. Une augmentation des valeurs Ct avec l'augmentation de la quantité de matrice serait une indication claire de la présence d'inhibiteurs de la PCR dans l'échantillon. Une augmentation du volume d'entrée de la PCR utilisée comme modèle dans la réaction de transcription inverse n'a pas affecté la valeur Ct générée par l'amplification qPCR pour (A) le transcrit de l'ARNr 5S et (B) le miR-21. En fait, les valeurs Ct ont tendance à diminuer avec l'augmentation du volume d'entrée de la PCR, ce qui indique que l'ARN purifié à partir du plasma à l'aide du kit Norgen est exempt des inhibiteurs courants habituellement présents dans le plasma.

Figure 11. Purification de l'ARN circulant acellulaire et de l'ARN exosomal à partir de différents volumes de plasma. Le kit Maxi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen (Cat# 56200) a été utilisé pour purifier l'ARN circulant et exosomal exempt de cellules à partir de 1,5 ml, 3 ml et 5 ml de plasma préparé à partir de sang prélevé sur du citrate comme anticoagulant. Deux millilitres de l'ARN purifié ont ensuite été utilisés comme modèle dans des réactions de RT-qPCR pour évaluer l'amplification (A) du transcrit de l'ARNr 5S de référence et (B) du miR-21. La valeur moyenne de Ct pour le transcrit de l'ARNr 5S et le miR-21 diminue de façon linéaire avec l'augmentation du volume d'entrée de l'échantillon.

Figure 12. Linéarité de l'ARN purifié à partir de volumes croissants de plasma à l'aide du kit Maxi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen. Le kit Maxi de purification de l'ARN circulant et exosomal exempt de cellules du plasma/sérum de Norgen (Cat# 56200) a été utilisé pour purifier l'ARN à partir de 1,5 ml, 3 ml et 5 ml de plasma préparé à partir de sang prélevé sur du citrate comme anticoagulant. Deux microlitres de l'ARN purifié ont ensuite été utilisés comme modèle dans les réactions de RT-qPCR pour évaluer la linéarité (A) du transcrit de l'ARNr 5S de référence et (B) du miR-21 à partir des différents volumes de plasma. Le kit Maxi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen a permis de récupérer 92 % du transcrit de l'ARNr 5S à partir de 3 ml de plasma par rapport à la quantité présente dans 1,5 ml de plasma. En outre, 90 % de la transcription de l'ARNr 5S a été récupérée à partir de 5 ml de plasma par rapport à la quantité présente dans 3 ml de plasma. En ce qui concerne le miR-21, le kit Maxi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen a permis de récupérer 91 % du miR-21 à partir de 3 ml de plasma par rapport à la quantité présente dans 1,5 ml de plasma. En outre, 90 % du miR-21 a été récupéré dans 5 ml de plasma par rapport à la quantité présente dans 3 ml de plasma.

Figure 13. Détermination de la quantité d'inhibition présente dans les échantillons d'ARN plasmatique lors de la détection du transcrit 5S humain et du miR-21.L'ADN a été isolé à partir de 1,5 ml, 3 ml et 5 ml de plasma à l'aide du kit Maxi de purification de l'ARN du plasma/sérum de Norgen (Cat# 56200). Des volumes croissants de l'élution (2, 4 et 8 µl) ont été utilisés dans une réaction de transcription inverse de 20 µl suivie d'une réaction d'amplification par qPCR afin d'observer toute diminution de la valeur Ct. Une augmentation des valeurs Ct avec l'augmentation de la quantité de matrice serait une indication claire de la présence d'inhibiteurs de la PCR dans l'échantillon. Une augmentation du volume d'entrée de la PCR utilisée comme modèle dans la réaction de transcription inverse n'a pas affecté la valeur Ct générée par l'amplification qPCR pour (A) le transcrit de l'ARNr 5S et (B) le miR-21. En fait, les valeurs Ct. ont tendance à diminuer avec l'augmentation du volume d'entrée de la PCR, ce qui indique que l'ARN purifié à partir du plasma à l'aide du kit de Norgen est exempt des inhibiteurs courants habituellement présents dans le plasma.