血浆/血清 RNA 纯化试剂盒

概述

这些试剂盒提供了一种快速、可靠和方便的方法，利用便捷的旋转柱法纯化和浓缩优质、高纯度和无抑制剂的无细胞循环和外泌体 RNA。这些试剂盒可以从新鲜或冷冻的血清或血浆样本中纯化 RNA，这些样本都是用 EDTA 或柠檬酸盐采集的血液。不应使用肝素采血制备的血浆样本，因为肝素会严重干扰许多下游应用，如 RT-PCR。纯化的血浆/血清 RNA 与所有下游应用完全兼容，包括 PCR、qPCR、甲基化敏感反转录 qPCR、反转录 PCR、Northern 印迹、RNase 保护和引物延伸、表达阵列检测和 NGS。

背景

血浆/血清中不含细胞的循环 RNA 或外泌体 RNA 有可能为某些癌症和疾病提供生物标志物。外泌体是一种 40 - 150 nm 的膜囊泡，由大多数细胞类型分泌。外泌体可存在于唾液、血液、尿液、羊水和恶性腹水等生物液体中。最近有越来越多的证据表明，这些囊泡充当着细胞信使的角色，向体内遥远的细胞和组织传递信息。这些外泌体可能在介导对感染性病原体和肿瘤的适应性免疫反应、组织修复、神经通信和病原蛋白转移方面发挥功能性作用。因此，外泌体 RNA 可作为包括癌症在内的各种疾病的生物标记物。由于外泌体包裹的 RNA 分子不会被 RNAses 降解，因此可以从血浆或血清等生物液体中有效地回收。

血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒

该试剂盒可从新鲜或冷冻的血清或血浆样本中纯化 RNA，样本量从 50 µL 到 200 µL 不等。纯化的血浆/血清 RNA 会以 10 µL 至 25 µL 的灵活最终体积进行洗脱。

血浆/血清 RNA 纯化 Midi 试剂盒

它采用双柱方法，可从新鲜或冷冻的血清或血浆样本中纯化 RNA，这些样本是用 EDTA 或柠檬酸盐采集的血液，体积从 250 µL 到 1.5 mL 不等。第一个色谱柱将处理大量输入的体液，然后在迷你色谱柱上进行浓缩，最终洗脱 50 µL 至 100 µL。

血浆/血清 RNA 纯化 Maxi 试剂盒

该试剂盒可从新鲜或冷冻的血清或血浆样本中纯化 RNA，这些样本是用 EDTA 或柠檬酸盐采集的血液，体积从 2 mL 到 5 mL 不等。第一个色谱柱将处理大量输入的体液，然后在迷你色谱柱上进行浓缩，最终洗脱 50 µL 至 100 µL。

纯化 EV 和外泌体后分离 RNA

用于超速离心、Exoquick 和过滤

类别号	名称	洗脱量	血浆/血清	尿液	细胞培养基
55000	血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒	10 à 25 µL	50 µL à 1 mL	250 µL à 1 mL	5 à 10 mL
35300	总 RNA 纯化微型试剂盒	20 à 50 µL	1 à 4 mL	2 à 10 mL	10 à 20 mL
17200	总 RNA 纯化试剂盒	50 à 100 µL	4 à 10 mL	11 à 30 mL	20 à 35 mL

细节

支持数据

图 1.从不同容量的血浆中纯化循环 RNA。Norgen 血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒用于从 50 µL、100 µL 和 200 µL 经 EDTA 采集的血浆中纯化循环 RNA。然后将 3 μL 纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以检测 miR-21（图 1A）和看家 5S rRNA 转录本（图 1B）。随着样本输入量的增加，miR-21（图 1A）和 5S rRNA 转录本（图 1B）的相对量呈线性增加。

图 2.将纯化的循环 RNA 洗脱到不同的洗脱体积中。Norgens 血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒用于从用 EDTA 采集的 200 µL 血浆中纯化循环 RNA，洗脱液分别为 10 µL、15 µL 和 25 µL。然后将 3 μL 纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以检测 miR-21（图 2A）和看家 5S rRNA 转录本（图 2B）。随着洗脱体积的增加，miR-21（图 2A）和 5S rRNA 转录本（图 2B）的相对含量也在增加，这表明血浆循环 RNA 在极低的洗脱体积内得到了有效浓缩。

图 3.从血浆中有效、一致地检测 miRNA。Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒能有效地从血浆中分离 miRNA。使用 Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒、竞争对手 Q 的试剂盒和竞争对手 E 的试剂盒从 200 µL 血浆中分离循环 miRNA。使用竞争对手 A 的试剂盒从 600 µL 中分离循环 miRNA。使用 miR-21 的特异性引物进行了干环 RT-q 聚合酶链式反应。简而言之，使用 Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒（竞争对手 Q 的试剂盒）纯化的 15 µL RNA 中的 1 µL，以及使用竞争对手 E 的试剂盒和竞争对手 A 的试剂盒纯化的 50 µL RNA 中的 3.3 µL，然后使用 miR-21 茎环反向引物进行 20 µL 反转录。在 20 µL 的实时聚合酶链式反应中使用了 3 µL 的反转录产物和引物来检测人类 miR-21。与其他分离方法相比，Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒对 miR-21 转录本的回收率最高，也最稳定。使用 Norgen 试剂盒从 200 µL 血浆中回收的 miRNA 高于使用竞争对手 A 试剂盒从 600 µL RNA 中纯化的回收率。

图 4.对低至 50 µL 血浆的小 RNA 进行测序。Norgen Biotek 开发了一种有效的管道，可对小体积血浆/血清进行小 RNA 测序。使用 Norgen 已获专利的样本制备技术，可从少至 50 µL 的血浆中有效、稳定地回收 RNA（此处以血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒为例，类别号：55000）。面板 A 显示，从 50 或 200 µL 的血浆中检测到的 microRNA 数量与 4 mL 的几乎相同。面板 B 是一张文氏图，显示在已确定的 microRNA 中，大多数都能在从 50 µL 到 4 mL 的所有血浆输入量中检测到。事实上，C 组的散点图显示，50 或 200 µL 血浆与 4 mL 血浆之间检测到的每种 microRNA 的相对表达水平都高度相关。

图 5.尿液和血浆中的 miRNA 图谱高度重叠。从三个不同的健康人身上采集血浆和中段尿液。使用 Norgen 的尿液外泌体 RNA 纯化试剂盒从每个尿液样本 20 mL 中分离出 RNA（类别号：47200），使用 Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒提取 200 µL 的每个血浆样本（类别号：55000）。然后使用 Illumina TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒生成小 RNA 文库，随后在 Illumina MiSeq 系统上进行测序。然后对同一人血浆和尿液中的映射 miRNA 列表进行比较。维恩图显示，每个人的尿液和血浆中的 miRNA 图谱高度重叠。

图 6.尿液中其他小 RNA 物种（Piwi-Interacting）的多样性增加。从三个不同的健康人身上采集血浆和中段尿液。使用 Norgen 的尿液外泌体 RNA 纯化试剂盒从每个尿液样本 20 mL 中分离出 RNA（类别号：47200），使用 Norgen 的血浆/血清 RNA 纯化迷你试剂盒提取 200 µL 的每个血浆样本（类别号：55000）。然后使用 Illumina TruSeq 小 RNA 文库制备试剂盒生成小 RNA 文库，随后在 Illumina MiSeq 系统上进行测序。上图显示，尿液中 piwi-interacting RNA（piRNA）的相对比例一直较高。

图 7.Norgen 的总 RNA 纯化试剂盒能从 HeLa 细胞中分离出 miRNA，其多样性优于主要竞争对手。使用 Norgen 的总 RNA 纯化试剂盒和竞争对手 Q 的领先 miRNA 试剂盒从 100 万个 HeLa 细胞中分离出包括 miRNA 在内的总 RNA，并将其应用于 MiSeq 测序仪上的 Illumina Small RNA 下一代测序。面板 A 显示，诺健总 RNA 纯化试剂盒比竞争对手能回收更多的 miRNA。特别是，在不使用苯酚的情况下，只需 20 分钟的 RNA 样本制备时间，就能以更快、更简单的程序实现更高的多样性。B 部分是检测到的 miRNA 平均 RPM（每百万读数）的散点图，用于比较 Norgen 和竞争对手的 miRNA 回收率。Norgens 总 RNA 纯化试剂盒回收的具有较高 RPM 的 miRNA 数量明显较多，如插图和面板 C 所示。

图 8.从不同体积的血浆中纯化无细胞循环 RNA 和外泌体 RNA。Norgens Plasma/Serum RNA Purification Midi Kit（类别号：56100）用于从 0.25 mL、0.75 mL 和 1.5 mL 血浆中纯化无细胞循环和外泌体 RNA。然后将 2 μL 纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以评估 (A) 家系 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的扩增情况。随着样本输入量的增加，5S rRNA 转录本和 miR-21 的平均 Ct 值呈线性下降趋势。

图 9.使用 Norgens Plasma/Serum RNA Purification Midi Kit 从不断增加的血浆中纯化的 RNA 的线性度。Norgens Plasma/Serum RNA Purification Midi Kit（类别号：56100）用于从 0.25 mL、0.7 mL 和 1.5 mL 血浆中纯化 RNA。然后将 2 μL 纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以评估来自不同血浆容量的 (A) 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的线性度。Norgens 血浆/血清 RNA 纯化 Midi 试剂盒能从 0.75 mL 血浆中回收 97% 的 5S rRNA 转录本和 miR-21 转录本，而 0.35 mL 血浆中的回收率仅为 97%。此外，与 0.75 mL 血浆中的含量相比，从 1.5 mL 血浆中回收了 95% 的 5S rRNA 转录本和 miR-21。

图 10.在检测人类 5S 转录本和 miR-21 时，确定血浆 RNA 样本中的抑制量。使用 Norgens Plasma/Serum RNA Purification Midi Kit（类别号：56100）从 0.25 mL、0.75 mL 和 1.5 mL 血浆中分离 RNA。在 20 µL 反转录反应和 q 聚合酶链式反应扩增反应中使用的洗脱液体积不断增加（2、4 和 8 µL），以观察 Ct 值的下降情况。随着模板量的增加，Ct 值也会增加，这清楚地表明样本中存在聚合酶链式反应抑制剂。增加反转录反应中用作模板的聚合酶链式反应输入体积不会影响 q 聚合酶链式反应扩增产生的 (A) 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的 Ct 值。事实上，Ct 值会随着聚合酶链式反应输入量的增加而降低，这表明使用 Norgens 试剂盒从血浆中纯化的 RNA 不含通常存在于血浆中的常见抑制剂。

图 10.从不同体积的血浆中纯化无细胞循环 RNA 和外泌体 RNA。Norgens 血浆/血清 RNA 纯化 Maxi 试剂盒（类别号：56200）用于从 1.5 mL、3 mL 和 5 mL 血浆中纯化无细胞的循环和外泌体 RNA。然后将两毫升纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以评估 (A) 家管 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的扩增情况。随着样本输入量的增加，5S rRNA 转录本和 miR-21 的平均 Ct 值呈线性下降趋势。

图 11.使用 Norgens Plasma/Serum RNA Purification Maxi Kit（诺金血浆/血清 RNA 纯化 Maxi Kit）从不断增加的血浆中纯化的 RNA 的线性度。Norgens Plasma/Serum Cell-Free Circulating and Exosomal RNA Purification Maxi Kit（类别号：56200）用于纯化 1.5 mL、3 mL 和 5 mL 血浆中的 RNA。然后将 2 μL 纯化的 RNA 用作 RT-q 聚合酶链式反应的模板，以评估来自不同血浆容量的 (A) 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的线性度。诺健血浆/血清 RNA 纯化 Maxi 试剂盒能够从 3 mL 血浆中回收 92% 的 5S rRNA 转录本，而 1.5 mL 血浆中的含量仅为 92%。此外，与 3 mL 血浆中的含量相比，从 5 mL 血浆中回收了 90% 的 5S rRNA 转录本。至于 miR-21，Norgens Plasma/Serum RNA Purification Maxi 试剂盒能从 3 mL 血浆中回收 91% 的 miR-21，而 1.5 mL 血浆中的含量为 91%。此外，相对于 3 mL 血浆中的含量，从 5 mL 血浆中回收了 90% 的 miR-21。

图 12.在检测人类 5S 转录本和 miR-21 时，确定血浆 RNA 样本中的抑制量。使用 Norgens Plasma/Serum RNA Purification Maxi Kit（类别号：56200）从 1.5 mL、3 mL 和 5 mL 血浆中分离 DNA。在 20 µL 反转录反应和 q 聚合酶链式反应扩增反应中使用的洗脱液体积不断增加（2、4 和 8 µL），以观察 Ct 值的下降情况。随着模板量的增加，Ct 值也会增加，这清楚地表明样本中存在聚合酶链式反应抑制剂。增加反转录反应中用作模板的聚合酶链式反应输入体积不会影响 q 聚合酶链式反应扩增产生的 (A) 5S rRNA 转录本和 (B) miR-21 的 Ct 值。事实上，随着聚合酶链式反应输入量的增加，Ct 值往往会降低，这表明使用 Norgens 试剂盒从血浆中纯化的 RNA 不含通常存在于血浆中的常见抑制剂。

试剂盒规格
样本量范围	50 to 200 μL
抗凝剂（用于血浆）*	EDTA 或柠檬酸盐
纯化的 RNA 大小	所有大小，包括小 RNA（< 200 nt）
最小洗脱体积	10 μL
最大洗脱体积	25 μL
完成 10 次净化所需的时间	15-20 分钟
平均产量**	视样本而定