Dispositivos de recogida y conservación de ácidos nucleicos en heces Dx

Figura 2. Integridad del ADN y ARN total de heces aislados de muestras de heces almacenadas. El ADN y el ARN se aislaron de 200 µl de heces conservadas de 4 donantes diferentes (carriles A a D) almacenados en una habitación. temperatura en los tiempos indicados (ADN a los 27 meses y ARN a los 7 días) utilizando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos en heces Norgen (n.º de cat. 45600). Luego, se cargaron 10 µl de los 75 µl de ácido nucleico eluido en un gel para análisis visual. Se aisló ADN de heces de alta integridad a partir de muestras de heces almacenadas a temperatura ambiente durante 27 meses y se aisló ARN de alta integridad de muestras de heces almacenadas durante 7 días a temperatura ambiente. Lane M es una escalera de ADN HighRanger de 1 kb de Norgen (n.º de cat. 11900).

Figura 3. Monitoreo de la estabilidad del ADN de adenovirus (Ad5subE1) agregado a muestras de heces almacenadas mediante el ensayo de PCR en tiempo real TaqMan. Las muestras de heces almacenadas se enriqueceron con 6 x 109 ufp/ml de adenovirus y se recogieron 200 µl de muestras en los momentos indicados. Luego se aisló el ADN de las heces utilizando el kit de aislamiento de ADN de las heces Norgen (n.º de catálogo 27600). Luego, se usaron 2 µl de ADN molde de cada 50 µl de elución en una reacción de PCR de 20 µl para detectar ADN de adenovirus. Se ha demostrado que el conservante de heces estabiliza el ADN del adenovirus durante hasta 21 semanas a temperatura ambiente, lo que indica que los tubos de recolección y conservación de ácidos nucleicos de heces de Norgen son un sistema de conservación de heces seguro y conveniente para el transporte de muestras.

Figura 4. El ADN de las heces es estable en un amplio rango de temperaturas. Se recolectaron heces de un donante sano utilizando tubos de recolección y almacenamiento de ácido nucleico de heces Norgen. Luego, las muestras se incubaron a temperatura ambiente (Fig. 3A) y 50 °C (Fig. 3B), respectivamente. Luego, se recogieron 200 µl de heces almacenadas y no almacenadas los días 1, 2, 4 y 7, y se aisló el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN en heces Norgen (n.º de catálogo 27600). Finalmente, se utilizaron 2 µL de elución en 20 µL de reacción de PCR en tiempo real (SYBR Green I) utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). Las heces conservadas generaron valores de Ct más bajos que las no conservadas en los diferentes momentos analizados, lo que indica la alta calidad del ADN conservado.

Figura 5. Estabilidad de genes humanos y bacterianos durante un período de 7 días. Se controlaron los genes de bacterias gastrointestinales humanas (GAPDH), gramnegativas (16S rDNA) y dos grampositivas a partir de muestras de heces almacenadas a temperatura ambiente con o sin conservante de heces Norgen. Se aisló ADN de 200 µl de muestras de heces frescas, sin conservantes y almacenadas los días 1, 2, 4 y 7 utilizando el kit de aislamiento de ADN Norgen Saddles (n.º de catálogo 27600). Luego, se usaron 2 µL de elución en 20 µL de reacción de PCR en tiempo real (SYBR Green I) usando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad). Se encontró que todos los genes estaban conservados y estables durante 7 días.

Figura 6. Agrupación jerárquica de muestras de heces a nivel de filo en diferentes condiciones de almacenamiento. La composición microbiana de las muestras de heces almacenadas en los tubos de recolección y almacenamiento de ácido nucleico de heces Norgen (Cat. 45630, 45660) no difirió significativamente de la de los controles (heces frescas del día 0 a temperatura ambiente) durante un período de 2 días, mientras no estaban conservadas. Las muestras de heces mostraron una distancia en el dendrograma con respecto al perfil de heces original.

Figura 7. Diferencia en los 5 microorganismos más abundantes en el filo en comparación con las heces frescas (día 0). La abundancia de Firmicuties, Bacteroidetes y Proteobacteria de la muestra de heces conservadas fue mayor que la de las heces frescas sin conservas (NP) después de 2 días de almacenamiento a temperatura ambiente, lo que indica que la originalidad del perfil de los microorganismos de la muestra conservada está mucho más cerca de la de la muestra de heces frescas (día 0).

Figura 8. Abundancia relativa de géneros bacterianos entre muestras de heces almacenadas y no almacenadas a temperatura ambiente durante 2 días. La conservación de la muestra de heces utilizando tubos de recogida y conservación de ácido nucleico Norgen (Cat. 45630, 45660) mostró una estrecha relatividad con la muestra de heces frescas (día 0).

Figura 9. Correlación entre lecturas metagenómicas bacterianas duplicadas usando (A) heces frescas (día 0) y heces almacenadas a temperatura ambiente durante 2 días y (B) heces frescas (día 0) y heces no almacenadas a temperatura ambiente durante 2 días. Se observó un mayor R2 para las heces frescas (día 0) y almacenadas, lo que sugiere una mayor consistencia entre las muestras de heces frescas y almacenadas.