Kit de purificación de ARN total

Descripción general del producto

Estos kits son adecuados para el aislamiento de ARN total a partir de una serie de muestras como células, bacterias, levaduras, virus y fluidos corporales como plasma/suero, sangre, saliva, LCR, etc. Extraiga ARN de alta calidad y pureza con excelentes valores de RIN y A260/A280 adecuados para aplicaciones posteriores como qRT-PCR, RT-PCR, microarrays, NGS y más. Estos kits purifican todos los tamaños de ARN, desde grandes ARNm, ARNnc hasta microARN (miARN) en la misma fracción sin necesidad de fenol. Aísla todas las secuencias de ARN a la misma velocidad independientemente de su tamaño. Además, cuando las secuencias de ARN son pequeñas (por ejemplo, miARN), la columna se une a ARN pequeños independientemente de su contenido en GC.

Detalles

Supporting Data

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Figure 1. High Quality of Isolated RNA with Complete Size Range.

Unlike most competitors' kits, Norgen's Total RNA Purification Kit allows for the isolation of all sizes of RNA, from the very large RNA down to the microRNA, without the use of phenol. Total RNA was isolated from 1 x 10⁹ *E. coli* cells using Norgen’s Total RNA Purification Kit and a competitor’s kit. Five microliters and 1 µL of the 50 µL isolated RNA was analyzed on an agarose gel (Panel A) and the Agilent® 2100 BioAnalyzer RNA Nano 6000 chip (Panel B), respectively. Note the presence of small RNA species (red square) in the samples isolated via Norgen's kit and the absence of these RNA species in the competitor RNA preparation.

Figure 2. Amplification of Both Large and Small RNAs in the Same Extraction.

Norgen's Total RNA Purification Kit isolates the complete size range of RNA, including small RNAs without the use of phenol. Total RNA was isolated from 0.75 million HeLa cells using Norgen's Total RNA Purification Kit, various silica-based competitors and phenol-based TRI Reagent. RT-PCR was performed according to Shi and Chiang (2005). Fifteen microliters of the 50 µL isolated RNA were polyadenylated in a 50 µL Poly-(A)-Polymerase reaction. Four microliters of the polyadenylated RNA were used in a 20 µL reverse transcription reaction with a poly T adaptor primer. One microliter of the reverse transcription was used in a 20 µL qPCR reaction with primers against the human microRNAs (*miR-19* and *miR-21*) and large mRNA (*S15*). Only the use of Norgen's Total RNA Purification Kit resulted in detection of both microRNAs and mRNA amplification products similar to Competitor 2's kit but without the use of phenol.

Figure 3. High Quality of RNA from a Diverse Range of Inputs.

Norgen's Total RNA Purification Kit allows RNA isolation from a wide range of species or tissue types. Total RNA was isolated from 5 x 10⁸ *E. coli* cells, 1 x 10⁶ HeLa cells, 100 µL rat blood and 10 mg hamster kidney using Norgen's Total RNA Purification Kit. One microliter of the 50 µL isolated RNA was analyzed on the Agilent® 2100 BioAnalyzer using an RNA Nano 6000 chip. Note the integrity of RNA from all inputs with the presence of small RNA species. Norgen's Total RNA Purification Kit consistently isolates high quality RNA from various inputs that score a RIN value between 8 and 10.

Figure 4. Great Isolation Sensitivity.

Norgen's Total RNA Purification Kit allows sensitive RNA extraction from as little as a single cell. Total RNA was extracted from a decreasing number of 293 HEK cells from 1 million cells down to a single cell. Five microliters of the 50 µL isolated RNA was then subjected to a 20 µL reverse transcription using oligo dT primer. Three microliters of the reverse transcription was used in a 20 µL PCR reaction with primers to detect the human beta-actin transcripts. PCR products of beta-actin were detected from as little as a single cell. M is the marker lane.

Figure 5. Linear and Sensitive Isolation of Both Large and Small RNA.

Norgen’s Total RNA Purification Kit allows consistent isolation of both large and small RNA from different input amounts. Total RNA was isolated from 10 to 100,000 HeLa cells using Norgen's Total RNA Purification Kit (blue), a competitor’s silica-based kit (green) and a phenol-based RNA extraction method (red). Relative expression of miR-21 (Panel A), and S15 (Panel B) was determined by RT-qPCR of total RNA samples. In brief, one microliter of the 50 µL isolated RNA was then subjected to a 20 µL reverse transcription using miR-21 stem-loop reverse primer or oligo dT primer. Two microliters of the reverse transcription was used in a 20 µL real-time PCR reaction with primers to detect the human miR-21 (Panel A) and the S15transcripts (Panel B). The resulting threshold cycle (Ct) values were plotted against input cell number. RNA isolated using Norgen's Total RNA Purification had the best linearity (higher R²) and sensitivity (lower Ct) for both large RNA (S15) and small RNA (miR-21).

Figure 6. Effective and Consistent Detection of miRNA from Plasma.

Norgen's Total RNA Purification Kit can effectively isolate miRNA from plasma. Total RNA was isolated from 50, 100 or 200 µL of rat plasma in triplicates using Norgen's Total RNA Purification Kit (blue), a competitor’s silica-based kit (green) and a phenol-based RNA extraction method (red). Stem loop RT-qPCR using primers specific to miR-21 was performed. In brief, two microliters of the 50 µL isolated RNA was then subjected to a 20 µL reverse transcription using miR-21 stem-loop reverse primer or oligo dT primer. Three microliters of the reverse transcription was used in a 20 µL real-time PCR reaction with primers to detect the human miR-21. Norgen's Total RNA Purification Kit is the only product that showed (1) consistent detection of miR-21 transcripts across all input volumes, and (2) Ct values correlated to input volume (decrease Ct with increase input).

Figure 7. Recovering Diverse miRNA Species from Plasma with Better Consistency.

Norgen's Total RNA Purification Kit isolates plasma RNA that performs more consistently in downstream applications such as microarrays. Total RNA including miRNA was isolated from 100 µL of mouse plasma in duplicate using Norgen's Total RNA Purification Kit, Competitor 1's leading miRNA Kit or a phenol-based RNA extraction method. One hundred nanograms of extracted RNA from each kit was applied to an Illumina microRNA expression profiling kit. Scatter plots display better consistency (better clustering) of replicate signals from Norgen's samples. Genes with Pval < 0.01 for both replicates were in blue. The associated table suggested that Norgen's protocol recovered the same diversity of miRNA with better consistency (higher r² value).

Figure 8. Better Diversity of miRNA Detected from Plasma.

Norgen's Total RNA Purification Kit isolates miRNA from plasma with better diversity than a leading competitor. Total RNA including miRNA was isolated from 100 µL of plasma using Norgen's Total RNA Purification Kit or 625 µL of plasma using Competitor A's leading miRNA Kit, and was applied to an NCode expression profiling kit. Microarray images suggested that Norgen's Total RNA Purification Kit (left) isolates a better diversity of miRNA from smaller input amount of plasma than the competitor’s miRNA kit (right). Image courtesy of LC Sciences, Houston.

Figure 9. Better Diversity of miRNA Detected from HeLa Cells using Illumina Small RNA Next Gen Sequencing.

Norgen's Total RNA Purification Kit isolates miRNA from HeLa cells with better diversity than a leading competitor. Total RNA including miRNA was isolated from 1 million HeLa cells using Norgen's Total RNA Purification Kit and Competitor Q's leading miRNA Kit, and was applied to Illumina Small RNA Next Gen Sequencing on a MiSeq sequencer. Panel A showed that Norgen’s Total RNA Purification Kit recovers a higher number of miRNAs than the competitor. In particular, the higher diversity is achieved with a faster and simpler procedure in as little as 20 minutes of RNA sample preparation time without the use of phenol. Panel B is a scatter plot of the average RPM (reads per million) of the miRNAs detected used to compare Norgen and the competitor's kit recovery of miRNA. Norgen's Total RNA Purification Kit recovered a significantly higher number of miRNAs that have higher RPM, as summarized in the graph insert as well as in Panel C.

Figure 10. Consistent Yield of High Quality RNA with Complete Size Range without the Use of Phenol.

Norgen's Total RNA Purification 96-Well Kit allows for the consistent isolation of high quality RNA, with complete sizes ranging from very large RNA down to small RNA without the use of phenol. Total RNA was isolated from 0.5 mL aliquots of an overnight culture of *E. coli* (~5 x 10⁸ cells/mL) using Norgen's Total RNA Purification 96-Well Kit in 16 replicates. Five microliters of the 75 µL isolated RNA were resolved on a 1.2% formaldehyde agarose gel. All 16 replicates showed both high yield and high quality. In addition, all replicates showed effective recovery of all sizes of RNA including the small RNA (arrow).

Figure 13. Great Isolation Sensitivity.

Norgen's Total RNA Purification Kit allows for sensitive RNA extraction from even less than 10 cells. RT-qPCR was used to detect mRNA isolated from various input amounts of HeLa cells, from 100,000 down to a single cell, using Norgen's Total RNA Purification 96-Well Kit. Ten microliters of the 75 µL isolated RNA were then subjected to a 20 µL reverse transcription using oligo dT primers. Three microliters of the reverse transcription were used in a 20 µL real-time PCR reaction with primers to detect the human S15 transcripts. The resulting Ct values were plotted against the input cell number. Total RNA was isolated and detected linearly from as little as a single HeLa cell.

Figure 14. Comparison of total RNA concentration and RNA quality from HeLa cells isolated using column, automated bead-based, and manual bead-based purification methods.

RT-qPCR targeting microRNA-21 showed consistent Ct values (Columns: 21.66; Automation: 19.90; Manual: 19.91), confirming effective small RNA recovery with all three methods

Figure 15. RT-qPCR analysis of microRNA-21 to evaluate small RNA recovery from total RNA purified by different methods.

Total RNA isolated from HeLa cells using manual, automated, and column-based methods was reverse-transcribed and amplified for microRNA-21. All three methods provided comparable Ct values (Automation: 14.89; Columns: 15.48; Manual: 15.57), demonstrating effective and consistent small RNA recovery across platforms.

Figure 16. Total RNA integrity comparison using different purification methods from 1 × 10⁶ HeLa cells.

Total RNA was extracted using the Total RNA Purification Kit (Magnetic Bead System) (Product #75400) on three different platforms: Isopure, KingFisher, and the manual Column Kit method. Each lane was loaded with 5 µL of eluate and run on a 1× MOPS / 10% formaldehyde agarose gel to assess RNA integrity. Distinct 28S and 18S rRNA bands (indicated by arrows) demonstrate high-quality RNA across all platforms. The consistency in band intensity and sharpness suggests efficient RNA recovery and integrity across all methods tested.

Datos de respaldo

Figura 1. Alta calidad del ARN aislado con una gama completa de tamaños. A diferencia de la mayoría de los kits de la competencia, el kit de purificación de ARN total de Norgen permite aislar todos los tamaños de ARN, desde el ARN muy grande hasta el microARN, sin utilizar fenol. El ARN total se aisló a partir de 1 x109 células de E. coli utilizando el kit de purificación de ARN total Norgens y un kit de la competencia. Cinco microlitros y 1 µl del ARN aislado de 50 µl se analizaron en un gel de agarosa (panel A) y en el chip Agilent® 2100 BioAnalyzer RNA Nano 6000 (panel B), respectivamente. Obsérvese la presencia de pequeñas especies de ARN (cuadrado rojo) en las muestras aisladas mediante el kit de Norgen y la ausencia de estas especies de ARN en la preparación de ARN competidor.

Figura 2. Amplificación de ARN grandes y pequeños en la misma extracción. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla toda la gama de tamaños de ARN, incluidos los ARN pequeños, sin utilizar fenol. El ARN total se aisló a partir de 0,75 millones de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen, varios competidores a base de sílice y el reactivo TRI a base de fenol. La RT-PCR se realizó según Shi y Chiang (2005). Quince microlitros del ARN aislado de 50 µl se poliadenilaron en una reacción de poli(A)-polimerasa de 50 µl. Se utilizaron cuatro microlitros del ARN poliadenilado en una reacción de transcripción inversa de 20 µl con un cebador adaptador poli T. Se utilizó un microlitro de la transcripción inversa en una reacción qPCR de 20 µl con cebadores contra los microARN humanos (miR-19 y miR-21) y el ARNm grande (S15). Sólo el uso del kit de purificación de ARN total de Norgen dio lugar a la detección tanto de microARN como de productos de amplificación de ARNm similares a los del kit del competidor 2, pero sin el uso de fenol.

Figura 3. Alta calidad del ARN a partir de una gama diversa de aportes. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite aislar ARN de una amplia gama de especies o tipos de tejidos. El ARN total se aisló a partir de 5 x108 células E. coli, 1 x106 células HeLa, 100 µl de sangre de rata y 10 mg de riñón de hámster utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen. Un microlitro de los 50 µl de ARN aislado se analizó en el bioanalizador Agilent® 2100 utilizando un chip RNA Nano 6000. Obsérvese la integridad del ARN de todas las entradas con presencia de pequeñas especies de ARN. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla sistemáticamente ARN de alta calidad a partir de diversos insumos que obtienen un valor RIN de entre 8 y 10.

Figura 4. Gran sensibilidad de aislamiento. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite la extracción sensible de ARN a partir de una sola célula. Se extrajo ARN total de un número decreciente de 293 células HEK, desde 1 millón de células hasta una sola célula. A continuación, cinco microlitros de los 50 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador oligo dT. Tres microlitros de la transcripción inversa se utilizaron en una reacción de PCR de 20 µl con cebadores para detectar los transcritos de beta-actina humana. Se detectaron productos PCR de beta-actina a partir de una sola célula. M es el carril marcador.

Figura 5. Aislamiento lineal y sensible de ARN grandes y pequeños. El Kit de Purificación de ARN Total de Norgens permite el aislamiento consistente de ARN grandes y pequeños a partir de diferentes cantidades de entrada. Se aisló ARN total de 10 a 100.000 células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen (azul), un kit basado en sílice de la competencia (verde) y un método de extracción de ARN basado en fenol (rojo). La expresión relativa de miR-21 (panel A) y S15 (panel B) se determinó mediante RT-qPCR de muestras de ARN total. En resumen, un microlitro de los 50 µl de ARN aislado se sometió a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador inverso de bucle de tallo de miR-21 o el cebador oligo dT. Se utilizaron dos microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano (panel A) y los transcritos S15 (panel B). Los valores de ciclo umbral (Ct) resultantes se representaron gráficamente frente al número de células de entrada. El ARN aislado mediante la purificación de ARN total de Norgen presentó la mejor linealidad (R2 más alto) y sensibilidad (Ct más bajo) tanto para el ARN grande (S15) como para el ARN pequeño (miR-21).

Figura 6. Detección eficaz y consistente de miARN a partir de plasma. El kit de purificación de ARN total de Norgen puede aislar eficazmente el miARN del plasma. El ARN total se aisló a partir de 50, 100 o 200 µl de plasma de rata por triplicado utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen (azul), un kit basado en sílice de la competencia (verde) y un método de extracción de ARN basado en fenol (rojo). Se realizó una RT-qPCR de asa de vástago utilizando cebadores específicos para miR-21. En resumen, dos microlitros de los 50 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador inverso de bucle de tallo de miR-21 o el cebador oligo dT. Tres microlitros de la transcripción inversa se utilizaron en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano. El kit de purificación de ARN total de Norgen es el único producto que mostró (1) detección consistente de transcritos de miR-21 en todos los volúmenes de entrada, y (2) valores de Ct correlacionados con el volumen de entrada (disminución de Ct con el aumento de entrada).

Figura 7. Recuperación de diversas especies de miARN del plasma con mejor consistencia. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla el ARN plasmático que se comporta de forma más consistente en aplicaciones posteriores como los microarrays. El ARN total, incluido el miARN, se aisló de 100 µl de plasma de ratón por duplicado utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen, el kit de miARN líder de Competitor 1 o un método de extracción de ARN basado en fenol. Cien nanogramos de ARN extraído de cada kit se aplicaron a un kit de perfiles de expresión de microARN de Illumina. Los gráficos de dispersión muestran una mayor coherencia (mejor agrupación) de las señales replicadas de las muestras de Norgen. Los genes con Pval < 0,01 para ambas réplicas aparecen en azul. La tabla asociada sugería que el protocolo de Norgen recuperaba la misma diversidad de miARN con mejor consistencia (mayor valor r2 ).

Figura 8. Mayor diversidad de miARN detectados en plasma. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla miARN del plasma con mejor diversidad que un competidor líder. El ARN total, incluido el miARN, se aisló a partir de 100 µl de plasma utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen o de 625 µl de plasma utilizando el kit de miARN líder del competidor A, y se aplicó a un kit de perfiles de expresión NCode. Las imágenes de micromatrices sugieren que el kit de purificación de ARN total de Norgen (izquierda) aísla una mayor diversidad de miARN a partir de una menor cantidad de plasma que el kit de miARN de la competencia (derecha). Imagen cortesía de LC Sciences, Houston.

Figura 9. Mejor diversidad de miARN detectados en células HeLa mediante secuenciación de próxima generación de ARN pequeños de Illumina. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla miARN de células HeLa con mejor diversidad que un competidor líder. El ARN total, incluido el miARN, se aisló a partir de 1 millón de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen y el kit de miARN líder de Competitor Q, y se aplicó a la secuenciación de próxima generación de ARN pequeño de Illumina en un secuenciador MiSeq. El panel A muestra que el kit de purificación de ARN total Norgens recupera un mayor número de miARN que el competidor. En particular, la mayor diversidad se consigue con un procedimiento más rápido y sencillo en tan sólo 20 minutos de tiempo de preparación de la muestra de ARN sin utilizar fenol. El panel B es un gráfico de dispersión del RPM medio (lecturas por millón) de los miARN detectados utilizados para comparar la recuperación de miARN de Norgen y del kit de la competencia. El kit de purificación de ARN total de Norgens recuperó un número significativamente mayor de miARN que tienen RPM más altas, como se resume en el inserto del gráfico así como en el panel C.

Figura 10. Producción consistente de ARN de alta calidad con una gama completa de tamaños sin el uso de fenol. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite el aislamiento consistente de ARN de alta calidad, con tamaños completos que van desde el ARN muy grande hasta el ARN pequeño sin el uso de fenol. El ARN total se aisló a partir de alícuotas de 0,5 ml de un cultivo de una noche de E. coli (~5 x108 células/mL) utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen en 16 réplicas. Cinco microlitros de los 75 µl de ARN aislado se resolvieron en un gel de agarosa con formaldehído al 1,2 %. Las 16 réplicas mostraron tanto un alto rendimiento como una alta calidad. Además, todas las réplicas mostraron una recuperación eficaz de todos los tamaños de ARN, incluido el ARN pequeño (flecha).

Figura 11. Alta calidad del ARN a partir de una gama diversa de aportes. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite aislar el ARN de una amplia gama de especies y tipos de tejidos. Se aisló ARN total a partir de 8 mg de tejido cerebral (líneas A), renal (líneas B), hepático (líneas C), pulmonar (líneas D) y esplénico (líneas E), 7,5 x105 células HeLa (líneas F) y CHO (líneas G), y 5 x108 bacterias (líneas H) utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen. Cinco microlitros de los 75 µl de ARN aislado se resolvieron en un gel de agarosa con formaldehído al 1,2 %. De la observación del gel de formaldehído-agarosa se desprende que el kit de Norgen puede utilizarse para aislar con éxito el ARN total, incluidas las especies de ARN pequeño, a partir de una amplia gama de tipos de muestras.

Figura 12. Aislamiento de ARN grandes y pequeños. El kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen permite aislar de forma consistente tanto el ARN grande como el pequeño. El ARN total se aisló a partir de muestras de 5 x105 células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de 96 pocillos de Norgen. A continuación, se utilizaron alícuotas de cada muestra de ARN total en 2 reacciones RT-qPCR diferentes. Diez microlitros de los 75 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando cebador inverso de bucle troncal de miR-21 u oligo dT. Se utilizaron tres microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano (panel A) y los transcritos S15 (panel B), respectivamente. Tanto el ARNm como el microARN se amplificaron de forma consistente a partir de todas las muestras, con una baja variabilidad de los valores Ct. Por lo tanto, ambos tipos de ARN se aíslan sistemáticamente con este kit.

Figura 13. Gran sensibilidad al aislamiento. El kit de purificación de ARN total de Norgen permite la extracción sensible de ARN incluso de menos de 10 células. La RT-qPCR se utilizó para detectar ARNm aislado a partir de diversas cantidades de células HeLa, desde 100.000 hasta una sola célula, utilizando el kit de 96 pocillos de purificación de ARN total de Norgen. A continuación, diez microlitros de los 75 µl de ARN aislado se sometieron a una transcripción inversa de 20 µl utilizando cebadores oligo dT. Se utilizaron tres microlitros de la transcripción inversa en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar los transcritos S15 humanos. Los valores Ct resultantes se representaron gráficamente frente al número de células de entrada. El ARN total se aisló y detectó linealmente a partir de una sola célula HeLa.

Especificaciones del kit
Capacidad máxima de unión	Hasta 50 μg de ARN
Volumen máximo de carga	650 μL
Tamaño del ARN purificado	Todos los tamaños, incluido el ARN pequeño (< 200 nt)
Cantidad máxima de material de partida
Células animales	3 x 10⁶ células
Tejidos animales	10 mg (para la mayoría de los tejidos*)
Sangre	100 μL
Plasma/Suero	200 μL
Bacterias	1 x 10⁹ células
Levadura	1 x 10⁸ células
Hongos	50 mg
Tejidos vegetales	50 mg
Tiempo para completar 10 purificaciones	20 minutos
Rendimiento medio
Células HeLa (1 x 10⁶ células)	15 μg
E. coli (1 x 10⁹ células)	50 μg

*Para aislar el ARN total de grandes cantidades de tejido, utilice el kit de purificación de ARN de tejido animal de Norgen (Cat# 25700)

Condiciones de almacenamiento y estabilidad del producto
Todas las soluciones deben mantenerse herméticamente cerradas y conservarse a temperatura ambiente. Estos kits son estables durante 2 años a partir de la fecha de envío.

Documentation

Alternate formats available upon request by emailing info@norgenbiotek.com. Such requests shall be made:

in a timely manner that considers the person's accessibility needs due to disability; and
at a cost that is no more than the regular cost charged to other persons