Purificación de ARN citoplasmático/nuclear

Figura 2. Separación superior de ARN citoplasmático y nuclear de células HeLa. El kit de purificación de ARN citoplasmático y nuclear de Norgen proporciona una mejor separación del ARN citoplasmático y nuclear de 0,8 millones de células HeLa en comparación con un producto líder de la competencia. Panel A: ARN citoplasmático y nuclear purificado a partir de células HeLa utilizando el kit de Norgen y un kit de la competencia. Diez microlitros de cada elución de 50 µl (Norgen o kit de la competencia) del ARN citoplasmático (C) o nuclear (N) se pasaron por un gel de formaldehído-agarosa al 1,5 %. Se aislaron mayores rendimientos de ARN con buena integridad utilizando el kit de Norgen. Panel B: Diez microlitros del ARN citoplasmático y nuclear aislado de células HeLa utilizando el kit de Norgen y el kit de la competencia se pasaron por un gel de agarosa al 0,9%. El ADN genómico sólo co-migra con la fracción nuclear en el ARN aislado utilizando el Kit de Purificación de ARN Citoplasmático y Nuclear de Norgen, no con la fracción citoplasmática. Obsérvese que se proporciona un protocolo opcional de tratamiento con DNasa en columna para eliminar el ADN genómico de la fracción nuclear. En cambio, se observó una contaminación significativa por ADN genómico en la fracción citoplasmática del ARN aislado con el kit de la competencia.

Figura 3. ARN citoplasmático sin ADN genómico. La RT-PCR se realizó utilizando cebadores de beta actina humana en 2 µl de los 50 µl de ARN citoplasmático aislado de 1 millón de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN citoplasmático y nuclear de Norgen. El carril M es la escalera de ADN PCR Sizer de Norgen, los carriles 1 y 3 son el control negativo (sólo PCR, sin transcripción inversa), y los carriles 2 y 4 son la RT-PCR real que muestran el producto RT-PCR esperado de 166 pb. El tamaño esperado del amplicón de la copia del gen es el mismo que el del transcrito del ARN. La ausencia de producto en los carriles 1 y 3 indica que no hay contaminación por ADN genómico en el ARN citoplasmático aislado. Todos los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa 1X TAE, al 2 %.

Figura 4. Separación específica y posterior amplificación de transcritos citoplasmáticos y nucleares. El kit de purificación de ARN citoplasmático y nuclear de Norgen separa eficazmente el ARN citoplasmático y nuclear. La RT-PCR se realizó utilizando cebadores de ARNsn U2 humano (panel A) o S14 (panel B) en 0,5 µg de fracciones de ARN citoplasmático o nuclear aisladas de 1 millón de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN citoplasmático y nuclear de Norgen. En el panel A, sólo se observó un producto PCR intenso en la fracción nuclear cuando se utilizaron los cebadores U2 snRNA específicos del núcleo. En el panel B, la mayor parte del producto PCR para el transcrito de mantenimiento de S14 se observó en la fracción citoplasmática. Los dos resultados combinados mostraron una separación eficaz del ARN citoplasmático y nuclear utilizando el kit de purificación de ARN citoplasmático y nuclear de Norgen. Todos los productos de PCR se resolvieron en un gel de ADN 1X TAE, 1,5 % agarosa.