Kits de limpieza y concentración de ARN

Figura 2. Limpieza eficaz para producir ARN total de alta calidad compatible con el análisis de bioanalizadores. El ARN total se aisló a partir de 0,75 millones de células HeLa utilizando un reactivo de extracción de ARN basado en fenol de la competencia. A continuación, el ARN resultante se purificó utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen. Como controles, el ARN total se extrajo utilizando tanto el kit de purificación de ARN total de Norgen (nº 17200, no requiere fenol) como el reactivo de extracción de ARN a base de fenol únicamente sin limpieza. La resolución de 1 µl del ARN purificado de 50 µl en un chip Agilent RNA Nano 6000 mostró que, sin limpieza, la muestra de ARN aislada utilizando el reactivo de extracción de ARN basado en fenol sólo se resolvía pobremente en un bioanalizador. Por el contrario, el ARN extraído con el reactivo de extracción de ARN a base de fenol seguido de una limpieza con el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen se resolvió correctamente en el bioanalizador mostrando una calidad excelente.

Figura 3. Concentración efectiva y detección de bajas cantidades de ARN de entrada. El kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen puede concentrar eficazmente entradas de ARN en el rango de los picogramos. Se concentraron cantidades crecientes de ARN HeLa en volúmenes de entrada de 50 µl hasta 20 µl utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen. A continuación, se utilizó una alícuota de 10 µl del ARN purificado como molde en una reacción qRT-PCR para detectar el gen S14. Las cantidades indicadas en el gráfico corresponden a la cantidad de ARN que se utilizó como entrada para la reacción qRT-PCR, lo que demuestra el rendimiento constante del kit incluso en el intervalo de picogramos.

Figura 4. Limpieza eficaz para producir transcritos de ARN de alta calidad. El kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen limpia eficazmente los transcritos de ARN con una alta recuperación. Se produjeron tres transcritos de ARN (1-3) de diferentes tamaños (266n, 161n y 419n, respectivamente) utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen. A continuación, los transcritos de ARN resultantes se purificaron utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen. La resolución de 7,5 µl de los 50 µl de ARN limpiado (C), así como un volumen igual de la entrada sin limpiar (I) en un gel de agarosa 1X MOPS, 1,5% formaldehído, mostró que el transcrito de ARN se había limpiado con éxito mediante el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen.

Figura 5. Limpieza eficaz para producir transcritos de ARN de alta calidad compatibles con el análisis de bioanalizadores. El kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen limpia eficazmente los transcritos de ARN con una alta recuperación. Se produjeron tres transcritos de ARN (1-3) de diferentes tamaños (266n, 161n y 419n, respectivamente) utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN de Norgen. La resolución de 1 µL de los 50 µL de transcritos de ARN limpiados en un Chip Agilent RNA Nano 6000 mostró que los transcritos de ARN limpiados por el Kit de Limpieza y Concentración de ARN de Norgen se resolvieron correctamente en el bioanalizador mostrando una excelente calidad.

Figura 6. Excelente calidad del ARN concentrado. El ARN total aislado de células HeLa (2 µg) se concentró en 8 µl utilizando el kit Micro-Elute de limpieza y concentración de ARN. La excelente calidad viene indicada por el electroferograma generado con el bioanalizador Agilent 2100 (RIN > 9). El ARN concentrado es un verdadero «ARN total», como puede observarse por la presencia de pequeñas especies de ARN. 

Figura 7. Alta recuperación de ARN concentrado. El ARN total aislado de células HeLa (17,5 µl) se concentró a 8 µl utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN Micro-Elute, lo que dio como resultado un aumento de 2-2,2 veces en la concentración de ARN, según se midió mediante la cuantificación del bioanalizador Agilent 2100.

Figura 8. Concentración del ARN total. Las cantidades indicadas de ARN HeLa se concentraron utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN Micro-Elute. Para cada cantidad de entrada, se procesó un volumen de 17,5 µl y el ARN se eluyó en 8 µl, lo que dio como resultado una concentración de 2,2 veces. Se utilizaron tres microlitros de cada eluido en reacciones de RT de 10 µl con el cebador oligo-dT, seguidas de PCR en tiempo real utilizando 3 µl del ADNc resultante y cebadores específicos para el gen RPS15 humano. Por término medio, las amplificaciones del ARN concentrado alcanzaron el valor umbral 1 Ct antes que las muestras de ARN de entrada, lo que era de esperar en función del factor de concentración. La cantidad de entrada más baja utilizada (240 pg) sólo se amplificó cuando se concentró (muestra más a la derecha en la figura).

Figura 9. Concentración de miARN. Las cantidades indicadas de ARN HeLa se concentraron utilizando el kit de limpieza y concentración de ARN Micro-Elute. Tres microlitros de cada eluido de 8 µl se utilizaron en reacciones de RT de 10 µl con el cebador miR-21-SLR, seguidas de PCR en tiempo real utilizando 3 µl del ADNc resultante y el cebador directo específico para miR-21.

Figura 10. Concentración del ARN antes de las aplicaciones de secuenciación de próxima generación (NGS). El ARN total se purificó a partir de 200 µl de plasma recogido en tubos de sangre con EDTA utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen (Cat. 17200) y se eluyó en 50 µl de solución de elución. El mismo ARN también se concentró dos veces utilizando la columna de ARN Micro-Elute eluyendo en 25 µl de solución de elución. Se utilizaron cinco microlitros tanto del ARN sin concentración adicional como del ARN concentrado 2X como entradas para generar bibliotecas de ARN (utilizando el NEBNext® Small RNA Library Prep Set para Illumina® y siguiendo las instrucciones del fabricante) para NGS de ARN pequeño en la plataforma MiSeq (Illumina). A) Las pequeñas bibliotecas de ARN preparadas se visualizaron en un gel de poliacrilamida TBE al 6 %, donde la biblioteca preparada con ARN concentrado 2X contenía más productos de ADNc de miARN ligados/indexados (147-160 pb) que la biblioteca preparada utilizando el ARN sin concentración. B) El ADNc se extrajo de las bandas de gel extirpadas y se interrogó con el bioanalizador Agilent 2100 (ensayo de ADN de alta sensibilidad). Como cabría esperar basándose en la entrada, la pequeña biblioteca de ARN preparada con la muestra de ARN concentrada 2X era aproximadamente dos veces más concentrada que la biblioteca preparada con ARN sin concentración previa (39,8 frente a 21,2 nM, respectivamente).