Figura 2. Eluyendo el ARN circulante purificado en diferentes volúmenes de elución. El Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Mini de Norgen se utilizó para purificar el ARN circulante de 200 µl de plasma preparado a partir de sangre recogida con EDTA y eluida en 10 µl, 15 µl y 25 µl. A continuación, se utilizaron tres microlitros del ARN purificado como molde en reacciones de RT-qPCR para detectar miR-21 (Figura 2A) y el transcrito del ARNr 5S de mantenimiento (Figura 2B). La cantidad relativa tanto del miR-21 (Figura 2A) como del transcrito del ARNr 5S (Figura 2B) aumenta al aumentar el volumen de elución, lo que indica la concentración eficaz del ARN circulante en plasma en un volumen de elución muy bajo.

Figura 3. Detección eficaz y coherente de miARN a partir de plasma. El Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Mini de Norgen puede aislar eficazmente miARN a partir de plasma. El miARN circulante se aisló a partir de 200 µl de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Mini de Norgen, el kit del competidor Q y el kit del competidor E. El miARN circulante se aisló a partir de 600 µl utilizando el kit del competidor A. Se realizó una RT-qPCR de asa de vástago utilizando cebadores específicos para miR-21. En resumen, 1 microlitro de los 15 µl de ARN purificado utilizando el mini kit de purificación de ARN de plasma/suero de Norgen, el kit del competidor Q y 3,3 microlitros de los 50 µl de ARN purificado utilizando el kit del competidor E y el kit del competidor A se sometieron a continuación a una transcripción inversa de 20 µl utilizando el cebador inverso de bucle troncal de miR-21. Tres microlitros de la transcripción inversa se utilizaron en una reacción de PCR en tiempo real de 20 µl con cebadores para detectar el miR-21 humano. El Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Mini de Norgen mostró la recuperación más consistente y alta de los transcritos de miR-21 en comparación con los otros métodos de aislamiento. La recuperación del miARN a partir de 200 µl de plasma utilizando el kit de Norgen fue superior a la recuperada a partir de ARN purificado a partir de 600 µl utilizando el kit del competidor A.

Figura 4. Secuenciación de pequeños ARN a partir de tan sólo 50 µl de plasma.Norgen Biotek ha desarrollado una eficaz línea de secuenciación de pequeños ARN a partir de pequeños volúmenes de plasma/suero. El ARN puede recuperarse de forma eficaz y consistente a partir de tan solo 50 µl de plasma utilizando la tecnología de preparación de muestras patentada de Norgen (ejemplo mostrado aquí con el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Mini de Norgen, Cat. 55000). El panel A muestra que el número de microARN detectados a partir de 50 o 200 µL de plasma era casi idéntico al de 4 mL. El panel B es un diagrama de Venn que muestra que de los microARN identificados, la mayoría se detectan en todos los volúmenes de entrada de plasma de 50 µL a 4 mL. De hecho, los gráficos de dispersión en el Panel C muestran que el nivel de expresión relativa de cada microARN detectado estaba altamente correlacionado entre 50 o 200 µL de plasma y 4 mL de plasma.

Figura 5. Alto grado de solapamiento del perfil de miARN entre la orina y el plasma. Se recogió plasma y orina en medio del chorro de tres individuos sanos diferentes. Se aisló el ARN de 20 mL de cada muestra de orina utilizando el kit de purificación de ARN exosómico de orina de Norgen (Cat. 47200) y 200 µL de cada muestra de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Mini de Norgen (Cat. 55000). A continuación, se generaron pequeñas bibliotecas de ARN utilizando un kit de preparación de pequeñas bibliotecas de ARN TruSeq de Illumina y, posteriormente, se secuenciaron en un sistema MiSeq de Illumina. A continuación, se comparó la lista de miARN mapeados de plasma y orina del mismo individuo. Los diagramas de Venn mostraron que los perfiles de miARN presentan un alto grado de solapamiento entre la orina y el plasma dentro de cada individuo.

Figura 6. Aumento de la Diversidad de Otras Especies de ARN Pequeño (que interactúa con piwi) en la Orina. Se recogió plasma y orina en medio del chorro de tres individuos sanos diferentes. Se aisló el ARN de 20 mL de cada muestra de orina utilizando el kit de purificación de ARN exosómico de orina de Norgen (Cat. 47200) y 200 µL de cada muestra de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Mini de Norgen (Cat. 55000). A continuación, se generaron pequeñas bibliotecas de ARN utilizando un kit de preparación de pequeñas bibliotecas de ARN TruSeq de Illumina y, posteriormente, se secuenciaron en un sistema MiSeq de Illumina. El gráfico anterior mostraba que la proporción relativa de ARN que interactúa con piwi (ARNip) era sistemáticamente mayor en la orina.

Figura 7. Mejor diversidad de miARN detectada a partir de células HeLa mediante secuenciación de próxima generación de ARN pequeños de Illumina. El kit de purificación de ARN total de Norgen aísla miARN a partir de células HeLa con mejor diversidad que un competidor líder. El ARN total, incluido el miARN, se aisló a partir de 1 millón de células HeLa utilizando el kit de purificación de ARN total de Norgen y el kit de miARN líder de Competitor Q, y se aplicó a la secuenciación de próxima generación de ARN pequeño de Illumina en un secuenciador MiSeq. El panel A muestra que el kit de purificación de ARN total de Norgen recupera un mayor número de miARN que el competidor. En particular, la mayor diversidad se consigue con un procedimiento más rápido y sencillo en tan sólo 20 minutos de tiempo de preparación de la muestra de ARN sin utilizar fenol. El panel B es un gráfico de dispersión del RPM medio (lecturas por millón) de los miARN detectados para comparar Norgen y la recuperación de miARN de los competidores. El kit de purificación de ARN total de Norgen recuperó un número significativamente mayor de miARN que tienen RPM más altas, como se resume en el inserto del gráfico así como en el panel C.

Figura 8. Purificación de ARN circulante libre de células y ARN exosomal a partir de diferentes volúmenes de plasma. Se utilizó el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Midi de Norgen (Cat# 56100) para purificar ARN circulante y exosomal libre de células a partir de 0,25 mL, 0,75 mL y 1,5 mL de plasma preparado con sangre extraída con citrato como anticoagulante. A continuación, se utilizaron dos microlitros del ARN purificado como molde en reacciones de RT-qPCR para evaluar la amplificación del (A) transcrito del ARNr 5S de mantenimiento y (B) miR-21. El valor Ct medio tanto para el transcrito del ARNr 5S como para el miR-21 disminuye linealmente al aumentar el volumen de entrada de la muestra.

Figura 9. Linealidad del ARN purificado a partir de volúmenes crecientes de plasma utilizando el kit de purificación de ARN en plasma/suero Midi de Norgen. Se utilizó el Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Midi de Norgen (Cat# 56100) para purificar ARN de 0,25 mL, 0,7 mL y 1,5 mL de plasma preparado a partir de sangre extraída con citrato como anticoagulante. A continuación, se utilizaron dos microlitros del ARN purificado como molde en las reacciones de RT-qPCR para evaluar la linealidad de (A) el transcrito del ARNr 5S de mantenimiento y (B) miR-21 a partir de los diferentes volúmenes de plasma. El Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Midi de Norgen fue capaz de recuperar el 97 % tanto del transcrito de ARNr 5S como del transcrito de miR-21 a partir de 0,75 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 0,35 mL de plasma. Además, se recuperó el 95 % del transcrito ARNr 5S y del miR-21 de 1,5 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 0,75 mL de plasma.

Figura 10. Determinación de la cantidad de inhibición presente en muestras de ARN plasmático al detectar el transcrito 5S humano y miR-21. El ARN se aisló de 0,25 mL, 0,75 mL y 1,5 mL de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Midi de Norgen (Cat# 56100). Se utilizaron volúmenes crecientes de la elución (2, 4 y 8 µl) en una reacción de transcripción inversa de 20 µl seguida de una reacción de amplificación qPCR para observar cualquier disminución del valor Ct. Un aumento de los valores Ct con el aumento de la cantidad de molde sería una clara indicación de la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra. Un aumento del volumen de entrada de la PCR utilizado como molde en la reacción de transcripción inversa no afectó al valor Ct generado a partir de la amplificación qPCR tanto para (A) el transcrito ARNr 5S como para (B) miR-21. De hecho, los valores Ct tienden a disminuir al aumentar el volumen de entrada de la PCR, lo que indica que el ARN purificado a partir del plasma mediante el kit de Norgen está libre de los inhibidores comunes que suelen estar presentes en el plasma.

Figura 11. Purificación de ARN circulante libre de células y ARN exosomal a partir de diferentes volúmenes de plasma. Se utilizó el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Maxi de Norgen (Cat# 56200) para purificar ARN circulante y exosomal libre de células a partir de 1,5 mL, 3 mL y 5 mL de plasma preparado con sangre extraída con citrato como anticoagulante. A continuación, se utilizaron dos mililitros del ARN purificado como molde en reacciones de RT-qPCR para evaluar la amplificación de (A) el transcrito del ARNr 5S de mantenimiento y (B) miR-21. El valor Ct medio tanto para el transcrito del ARNr 5S como para el miR-21 disminuye linealmente al aumentar el volumen de entrada de la muestra.

Figura 12. Linealidad del ARN purificado a partir de volúmenes crecientes de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Maxi de Norgen. Se utilizó el Kit de Purificación de ARN Exosomal y Circulante Libre de Células de Plasma/Suero Maxi de Norgen (Cat# 56200) para purificar ARN de 1,5 mL, 3 mL y 5 mL de plasma preparado a partir de sangre extraída con citrato como anticoagulante. A continuación, se utilizaron dos microlitros del ARN purificado como molde en las reacciones de RT-qPCR para evaluar la linealidad de (A) el transcrito del ARNr 5S de mantenimiento y (B) miR-21 a partir de los diferentes volúmenes de plasma. El Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Maxi de Norgen fue capaz de recuperar el 92 % del transcrito de ARNr 5S a partir de 3 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 1,5 mL de plasma. Además, se recuperó el 90 % del transcrito 5S ARNr de 5 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 3 mL de plasma. En cuanto a miR-21, el Kit de Purificación de ARN en Plasma/Suero Maxi de Norgen fue capaz de recuperar el 91 % de miR-21 a partir de 3 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 1,5 mL de plasma. Además, se recuperó el 90 % de miR-21 de 5 mL de plasma en relación con la cantidad presente en 3 mL de plasma.

Figura 13. Determinación de la cantidad de inhibición presente en muestras de ARN plasmático al detectar el transcrito 5S humano y miR-21. Se aisló el ADN de 1,5 mL, 3 mL y 5 mL de plasma utilizando el Kit de Purificación de ARN de Plasma/Suero Maxi de Norgen (Cat# 56200). Se utilizaron volúmenes crecientes de la elución (2, 4 y 8 µl) en una reacción de transcripción inversa de 20 µl seguida de una reacción de amplificación qPCR para observar cualquier disminución del valor Ct. Un aumento de los valores Ct con el aumento de la cantidad de molde sería una clara indicación de la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra. Un aumento del volumen de entrada de la PCR utilizado como molde en la reacción de transcripción inversa no afectó al valor Ct generado a partir de la amplificación qPCR tanto para (A) el transcrito ARNr 5S como para (B) miR-21. De hecho, los valores Ct. tienden a disminuir al aumentar el volumen de entrada de la PCR, lo que indica que el ARN purificado a partir del plasma mediante el kit de Norgen está libre de los inhibidores comunes que suelen estar presentes en el plasma.