Purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire

Figure 2. Séparation supérieure de l'ARN cytoplasmique et nucléaire des cellules HeLa. Le kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen permet une meilleure séparation de l'ARN cytoplasmique et nucléaire à partir de 0,8 million de cellules HeLa par rapport à un produit concurrent de premier plan. Groupe A : ARN cytoplasmique et nucléaire purifié à partir de cellules HeLa à l'aide du kit de Norgen et d'un kit concurrent. Dix microlitres de chaque élution de 50 µL (Norgen ou kit concurrent) de l'ARN cytoplasmique (C) ou nucléaire (N) ont été passés sur un gel de formaldéhyde-agarose à 1,5 %. Des rendements plus élevés d'ARN avec une bonne intégrité ont été isolés en utilisant le kit de Norgen. Groupe B : Dix microlitres d'ARN cytoplasmique et nucléaire isolés à partir de cellules HeLa à l'aide du kit de Norgen et du kit du concurrent ont été analysés sur un gel d'agarose à 0,9 %. L'ADN génomique ne co-migre qu'avec la fraction nucléaire de l'ARN isolé à l'aide du kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen, et non avec la fraction cytoplasmique. Il convient de noter qu'un protocole optionnel de traitement à l’ADNase sur colonne est fourni pour éliminer l'ADN génomique dans la fraction nucléaire. En revanche, une contamination significative par l'ADN génomique a été observée dans la fraction cytoplasmique de l'ARN isolé à l'aide du kit du concurrent.

Figure 3. ARN cytoplasmique sans ADN génomique. La RT-PCR a été réalisée en utilisant des amorces de bêta-actine humaine sur 2 µL des 50 µL d'ARN cytoplasmique isolés à partir de 1 million de cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen. La voie M est l'échelle d'ADN de calibreur PCR de Norgen, les voies 1 et 3 sont le contrôle négatif (PCR uniquement, sans transcription inverse), et les voies 2 et 4 sont la RT-PCR réelle qui montre le produit RT-PCR attendu de 166 pb. La taille attendue de l'amplicon provenant de la copie du gène est la même que celle provenant de la transcription de l'ARN. L'absence de produit dans les voies 1 et 3 indique qu'aucune contamination par l'ADN génomique n'est présente dans l'ARN cytoplasmique isolé. Tous les produits PCR ont été résolus sur un gel d'agarose 1X TAE, 2 %.

Figure 4. Séparation spécifique et amplification ultérieure des transcrits cytoplasmiques et nucléaires.Le kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen sépare efficacement l'ARN cytoplasmique et nucléaire. La RT-PCR a été réalisée à l'aide d'amorces U2 ARNsn humain (groupe A) ou S14 (groupe B) sur 0,5 µg de fractions d'ARN cytoplasmique ou nucléaire isolées à partir de 1 million de cellules HeLa à l'aide du kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen. Dans le groupe A, un produit PCR intense a été observé uniquement dans la fraction nucléaire lorsque les amorces U2 ARNsn spécifiques au nucléaire ont été utilisées. Dans le panneau B, la majorité du produit PCR pour le transcrit de maintien de S14 a été observée dans la fraction cytoplasmique. Les deux résultats combinés ont montré une séparation efficace de l'ARN cytoplasmique et nucléaire à l'aide du kit de purification de l'ARN cytoplasmique et nucléaire de Norgen. Tous les produits PCR ont été résolus sur un gel d'ADN 1X TAE, 1,5 % d'agarose.